Estudio de la recuperación primaria de ADN plasmídico a partir de lisados de E coli por microfiltración de lecho profundo

Abstract

Desde la última década, numerosos estudios han sido publicados sobre la posible aplicación de ADN plasmidico en terapia génica y en la producción de vacunas. El éxito de estas técnicas que utilizan ADN plasmidico como vector, depende del desarrollo de bioprocesos que entreguen este material de la mejor calidad y además sean escalables y sustentables. El proceso para la preparación del ADNp involucra una etapa de producción de células de E. coli por fermentación seguida de una recuperación primaria que incluye las etapas de resuspensión de biomasa, lisis alcalina, neutralización del lisado y clarificación por centrifugación, después se pasa a una recuperación secundaria donde se trata de concentrar el ADNp de interés por medio de ultrafiltración para realizar la purificación final por medio de cromatografía. La microfiltración de lecho profundo aparece como alternativa en la etapa de recuperación primaria, para clarificar el lisado neutralizado y de esta manera quitar la mayor cantidad de agregados solidos formados durante el proceso de lisis y neutralización. Esta es una técnica que consiste en la separación de un sólido de un fluido por acción de un medio filtrante y un gradiente de presión, donde pequeñas partículas suspendidas en el fluido son depositadas en diferentes profundidades dentro de los poros de un lecho de material. En el presente trabajo, se utilizó la macromolécula conteniendo el plásmido pVAX1-NH36 de 4 kpb hospedado en la cepa E. coli DH5a. Se desarrolló la etapa de recuperación primaria por medio de la resuspensión, lisis alcalina y neutralización de la biomasa, para después realizar la clarificación por filtración al vacío y microfiltración de lecho profundo con diferente tamaño de poro: 4 y 8 μ.m, y diferente flujo volumétrico: 4 y 6 cm3/min, además se llevó a cabo la clarificación del lisado neutralizado por medio de la operación de centrifugación, para así realizar una comparación entre ambos procesos. Se utilizó un modelo de taponamiento por recubrimiento de fibras del medio filtrante para conocer el comportamiento del sistema de microfiltración de lecho profundo. El proceso de microfiltración de lecho profundo resulto ser eficiente para la remoción de sólidos agregados en comparación de la clarificación por centrifugación.